A sociedade moderna procura por formas de desenvolver processos mais sustentáveis que reduzam as emissões de carbono, promovam a reutilização adequada de resíduos, diminuam a dependência de petróleo e utilizem a biomassa lignocelulósica como matéria-prima para a produção de combustíveis, produtos químicos, energia e materiais. O objetivo deste projeto é desenvolver um sistema eficiente de degradação da biomassa lignocelulósica por meio de coquetéis enzimáticos produzidos por micro-organismos, que integrem holocelulases com uma nova galactolipase como enzima acessória. A utilização de galactolipases em biomassas vegetais ainda não foi explorada pela comunidade científica, assim, fazer uma investigação molecular e expressão heteróloga será de grande avanço para o uso eficiente em biorrefinarias de biomassa. Estas enzimas farão parte de coquetéis enzimáticos que visam à degradação de material lignocelulósico proveniente de cana-de-açúcar e demais resíduos agrícolas, além de buscar obter novos biomateriais de interesse industrial e econômico. O objetivo final é desenvolver processos mais sustentáveis e eficientes para a biotransformação de biomassa que possam reduzir as emissões de carbono e diminuir a dependência de petróleo. Esta proposta está vinculada ao projeto temático INCT Bioetanol, coordenado pelo Prof. Dr. Marcos Buckeridge e aprovado pela FAPESP/CNPq (14/50884-5).

A tecnologia CRISPR abriu novas perspectivas para a reprogramação genética de organismos e tem impactado a genética molecular de Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo chave para biotecnologia. Recentemente propomos uma nova abordagem de CRISPR (EasyGuide) baseada na recombinação eficiente de gRNAs in vivo em S. cerevisiae (ACS Synth. Biol. 2022, 11, 11, 3886-3891). O EasyGuide omite a etapa de pré-clonagem do gRNA em E. coli e, com isso, acelera os procedimentos de edições genômicas. Neste projeto propomos expandir as ferramentas EasyGuide para incluir plasmídeos compactados, apresentando maior eficiência nas aplicações CRISPR. Os novos vetores irão permitir a clonagem in vivo de bibliotecas de oligos para montagem de gRNAs usados em screenings de CRISPRi (interferência) ou CRISPRa (ativação) para tolerância de leveduras a hidrolisados de cana-de-açúcar. Como nova abordagem, plasmídeos EasyGuide remodelados irão facilitar a clonagem e recombinação genômica de bibliotecas de oligos especificando substituições de aminoácidos mimetizando fosforilações (Ser para Asp; Tre para Asp) e desfosforilações (Ser to Ala; Tre to Ala) sobre os módulos regulatórios da proteína Msn2, um fator de transcrição chave para respostas de estresse em S. cerevisiae. Com ensaios das bibliotecas MSN2-modificadas sob condições de estresse ambiental (i.e., alto teor de etanol), ou enriquecendo variantes ativadas/desativadas da Msn2 pela expressão do biosensor HSP12-GFP analisada por Fluorescence-activated cell sorting, visamos o ganho de informações sobre a regulação da proteína Msn2 e, ao mesmo tempo, a prospecção de mutações miméticas de fosfo/desfosforilação que impactem a fermentação de leveduras em condições industriais. O EasyGuide é, portanto, visto como uma ferramenta versátil auxiliando na produção de materiais e combustíveis renováveis por leveduras.

O crescente aumento da demanda mundial por energia, a consequente exploração de fontes não renováveis para a produção de combustíveis fósseis acompanhados pelas mudanças climáticas atribuídas ao aumento da concentração de CO2 e outros gases de efeito estufa, provocou o interesse na geração e uso de energias renováveis e sustentáveis. Diante da alta demanda de combustíveis direcionados ao setor de transporte, o bioetanol apresenta-se como uma potencial alternativa para substituição da gasolina. Este biocombustível é obtido a partir da fermentação da biomassa oriunda de diferentes matérias-primas, como a cana-de-açúcar, resíduo florestal agrícola e algas. O bioetanol obtido a partir da biomassa de microalgas tem despertado interesse devido ao seu fácil cultivo, alto acúmulo de carboidratos em suas células e, principalmente, sua elevada eficiência fotossintética, contribuindo para mitigação de CO2. Entretanto, para sua efetiva produção, é necessário identificar cepas capazes de aumentar o acúmulo de carboidratos associado à alta produtividade de biomassa sob determinadas condições de cultivo. Além disso, os carboidratos acumulados pelas microalgas precisam ser hidrolisados para que micro-organismos fermentadores possam transformá-los em etanol. Deste modo, este projeto tem como objetivo a triagem e seleção de microalgas previamente isoladas de locais impactados, com reconhecido potencial de produção de bioprodutos de interesse biotecnológico, a fim de promover elevada produção de biomassa com o máximo acúmulo de carboidratos, além de determinar as melhores condições de hidrólise para possibilitar, então, máxima taxa de conversão em bioetanol. (AU)

A produção de bioetanol a partir de açúcares extraídos de cana-de-açúcar ou de milho contribui tanto para o desenvolvimento econômico do país, como para o meio ambiente, por se tratar de um recurso renovável, com produção líquida de carbono neutra. Entretanto, para melhorar o aproveitamento dos cultivares já plantados no país, a utilização da biomassa lignocelulósica é uma excelente alternativa como fonte de carbono para a produção de etanol de segunda geração. Contudo, o uso de enzimas para a sacarificação enzimática da lignocelulose presente nessa biomassa representa um dos maiores custos no modelo de negócios de uma planta industrial, chegando a 45% do valor de produção do etanol. Ainda, o fornecimento de enzimas em escala industrial para sacarificação de biomassa lignocelulósica é feito por apenas uma empresa no mundo, situada fora do Brasil. Dessa forma, são necessários estudos de produção de coquetéis enzimáticos eficientes, de tecnologia nacional, com bom rendimento de açúcares fermentescíveis (C5 e C6), além do baixo custo de produção. O presente projeto propõe o screening de fungos filamentos para a produção de um coquetel de holocelulases. Estes micro-organismos serão avaliados quanto a possibilidade de crescerem em sistema de co-cultivo, em biorreator de batelada, utilizando resíduos industriais como fonte de carbono. Uma vez produzido o extrato enzimático, esse será caracterizado e utilizado para a hidrólise da palha de cana. Para aumentar o rendimento do bioprocesso, serão expressas heterologamente enzimas chaves para o processo de conversão da biomassa lignocelulósica, que se juntarão ao coquetel gerado por co-cultivo. Para isso, serão utilizados dois sistemas modelos, a expressão heteróloga na levedura Picchia pastoris, além da expressão no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. Nesse projeto almeja-se desenvolver um processo de produção de um coquetel enzimático em sistema on site manufacture (OSM), o qual deverá ser implantado na planta de produção de etanol de segunda geração da GranBio SA, localizada em Alagoas, Brasil.

A produção de bioetanol a partir de açúcares extraídos de cana-de-açúcar ou de milho contribui tanto para o desenvolvimento econômico do país, como para o meio ambiente, por se tratar de um recurso renovável, com produção líquida de carbono neutra. Entretanto, para melhorar o aproveitamento dos cultivares já plantados no país, a utilização da biomassa lignocelulósica é uma excelente alternativa como fonte de carbono para a produção de etanol de segunda geração. Contudo, o uso de enzimas para a sacarificação enzimática da lignocelulose presente nessa biomassa representa um dos maiores custos no modelo de negócios de uma planta industrial, chegando a 45% do valor de produção do etanol. Ainda, o fornecimento de enzimas em escala industrial para sacarificação de biomassa lignocelulósica é feito por apenas uma empresa no mundo, situada fora do Brasil. Dessa forma, são necessários estudos de produção de coquetéis enzimáticos eficientes, de tecnologia nacional, com bom rendimento de açúcares fermentescíveis (C5 e C6), além do baixo custo de produção. O presente projeto propõe o screening de fungos filamentos para a produção de um coquetel de holocelulases. Estes micro-organismos serão avaliados quanto a possibilidade de crescerem em sistema de co-cultivo, em biorreator de batelada, utilizando resíduos industriais como fonte de carbono. Uma vez produzido o extrato enzimático, esse será caracterizado e utilizado para a hidrólise da palha de cana. Para aumentar o rendimento do bioprocesso, serão expressas heterologamente enzimas chaves para o processo de conversão da biomassa lignocelulósica, que se juntarão ao coquetel gerado por co-cultivo. Para isso, serão utilizados dois sistemas modelos, a expressão heteróloga na levedura Picchia pastoris, além da expressão no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. Nesse projeto almeja-se desenvolver um processo de produção de um coquetel enzimático em sistema on site manufacture (OSM), o qual deverá ser implantado na planta de produção de etanol de segunda geração da GranBio SA, localizada em Alagoas, Brasil. (AU)

O antimicrobiano gerador de radicais livres (formulação denominada de Oniorgan) é uma formulação em forma sólida resultante da mistura de quatro princípios ativos que em solução aquosa produzem os princípios ativos (peróxido de hidrogênio, ácido peracético e oxigênio), sanitizantes de alta eficiência encontrados atualmente na forma líquida, portanto requerem cuidados especiais no manuseio, transporte e armazenagem por serem tóxicas e explosivas. O Oniorgan será oferecido de forma sólida (não requerendo cuidados adicionais por não serem tóxicos em seu manuseio) e será ativado através de diluições com liberação dos geradores de radicais livres como alternativa de descontaminação inédita do processo de produção de bioetanol. O objetivo do presente projeto é dar continuidade no desenvolvimento da formulação do Oniorgan em escala de laboratório, que nos permitirão avaliar a dosagem mínima e forma de aplicação em processo de produção de bioetanol, para atingir a máxima excelência do produto evitando dosagens excessivas. Resultados preliminares obtidos em processos fermentativos, em escala de laboratório e industrial, indicam que o Oniorgan (utilizado em concentração de 200 ppm) é eficiente na descontaminação bacteriana. Os dados apresentaram aumento médio de produção de bioetanol da ordem de até 3%. O Oniorgan será produzido em parceria com a empresa Onibras e será dissolvido e analisado em resposta aos teores de princípios ativos para dosagem e controle de qualidade do produto. A levedura Saccharomyces cerevisiae livre de antimicrobianos e antibióticos e o mosto de caldo de cana-de-açúcar serão obtidos do processo industrial de produção de bioetanol do Grupo São Martinho-Santa Cruz. Os ensaios de fermentabilidade serão realizados em parceria com a Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. O mosto de caldo de cana-de-açúcar será inoculado com creme de S. cerevisiae. As fermentações serão conduzidas por 8h e monitorada as seguintes variáveis: pH, açúcares, etanol, ácidos orgânicos, viabilidade e vitalidade do levedo, além do nível de contaminação bacteriana. O vinho e o levedo serão ambos recuperados por centrifugação. Nesta etapa o levedo será tratado com diferentes cargas de Oniorgan em meio ácido ou próximo do neutro a fim de se determinar a concentração ideal do produto inovador. Os ensaios de fermentabilidade previamente selecionados na etapa anterior serão avaliados em comparação ao uso de monensina e óxido de cloro, sendo o levedo previamente recuperado ao final e avaliado quanto aos teores de organoclorados e monensina. Em relação ao potencial comercial do Oniorgan, há um amplo mercado, em especial no setor sucroenergético, que faz uso contínuo dos princípios ativos monensina (antibiótico) e óxido de cloro, os principais antimicrobianos usados para controle de contaminação bacteriana em processos fermentativos de produção de bioetanol. (AU)

Propomos a aplicação de extensas técnicas clássicas de simulação MD e QM/MM para projetar mutações que possam aumentar a estabilidade térmica e a eficiência catalítica de enzimas para aplicações industriais. O foco principal do projeto será em xilanases e outras hidrolases glicosídicas (GHs) para sacarificação de polissacarídeos lineares de biomassa lignocelulósica, mas outras enzimas de interesse industrial, incluindo esterases, fitases e possivelmente outras, também podem ser consideradas à medida que o projeto evolui . A análise da paisagem conformacional, afinidade de ligação do ligante e itinerário catalítico serão realizados em mutantes putativos e comparados entre eles e com o tipo selvagem. As estratégias de prospecção de mutações candidatas para avaliação molecular in silico contarão com as varreduras Rosetta para alinhamento de sequências e varreduras de dissulfidização, além de nossa própria pesquisa automatizada. (AU)

A indústria de etanol de segunda geração se baseia na fermentação de xilose, presente em biomassa lignocelulósica. Linhagens geneticamente modificadas de Saccharomyces cerevisiae realizam a assimilação deste açúcar, mas enfrentam condições desfavoráveis características da escala industrial de produção. São gerados ao longo do processo inibidores que afetam negativamente o desempenho de S. cerevisiae e a eficiência da conversão dos açúcares. Subprodutos como o 5-hidroximetilfurfural (HMF) e a incidência de flutuações de temperatura são dois grandes exemplos. Nesse contexto, a toxicidade do ambiente industrial estimula a busca por linhagens robustas que apresentem fenótipos de resistência a essas adversidades e prevaleçam em seu poder fermentativo. Em estudo publicado em 2021, de Mello e cols. Identificaram novos genes causativos para resistência a HMF e termotolerância na cepa resistente SA-1, entre eles SEA4 - que regula positivamente a sinalização em TORC1. Evidências apontam para a possibilidade de efeitos aditivos na geração do fenótipo em uma complexa rede de interação gênica que envolve vias de sinalização intracelular essenciais, como a via de integridade da parede celular (CWI) e alvo de rampamicina (TOR). A presente proposta busca investigar as bases genéticas subjacentes a este fenótipo que garante robustez através da substituição dos alelos previamente identificados em pares, para avaliar a presença de efeitos aditivos e/ou epistáticos. A continuidade desta linha de pesquisa traz a possibilidade de melhoramento contínuo com a descoberta de mais alvos para melhoramento genético de S. cerevisiae na fermentação da xilose e maior compreensão sobre a contribuição das vias CWI e TORC1 para a robustez industrial.(AU)

Um dos maiores desafios da pesquisa em biotecnologia é encontrar novas maneiras de aumentar a produtividade, reduzir custos e, ao mesmo tempo, desenvolver novos processos que melhorem a qualidade dos produtos. Assim para atender esta demanda, as análises realizados para monitoramento dos bioprocessos desempenham um papel crucial, principalmente quando se trabalha com matérias primas complexas, como a biomassa vegetal oriunda de subprodutos agrícolas e florestais. s técnicas analíticas como a espectrofotometria e a cromatografia desempenham um papel importante em muitos processos biotecnológicos e também na indústria química. Os laboratórios de pesquisa muitas vezes necessitam identificar e quantificar concentrações muito pequenas de produtos como açúcares, produtos e pigmento como a melanina (indesejável na produção de pululana). O presente plano visa ao treinamento técnico de um profissional no uso de técnicas de análise aplicadas ao pré-tratamento e à conversão de biomassa lignocelulósica em etanol e pululana. O bolsista dará suporte às etapas principais dos projetos em andamento no LBBSIM-EEL, sendo que ênfase será dada à análise de açúcares e etanol por cromatografia líquida de alta eficiência, caracterização da biomassa lignocelulósica, espectrofotometria para análise de melanina e lignina solúvel, além de realizar análise gravimétrica para quantificação de pululana.

O bagaço de cana-de-açúcar, constitui uma matéria prima promissória para a produção de etanol de segunda geração, porém o seu uso, apresenta desafios, desde os altos custos do pre-tratamento e a hidrolise, associados à recalcitrância da parede celular, que limita o rendimento de sacarificação. Embora as pectinas, tem sido amplamente negligenciados como componentes importantes da parede celulare, por seu baixo conteúdo (~8%) em cana-de-açúcar, conferem recalcitrância por ser responsáveis pela adesão e porosidade celular, limitando o trafego de glicosil hidrolases que favoreceriam os passos subsequentes da hidrolise dos outros polissacarídeos. Um dos processos de degradação endógena eficiente da parede celular é a formação de aerênquima lisígeno que ocorre em raízes cana-de-açúcar e estudos preliminares sugerem aprofundar a pesquisa em aspectos chaves dos mecanismos iniciais (perda de adesão, aumento da porosidade e afrouxamento da parede) deste processo para se direcionar em bioenergia, a partir da procura e seleção de genes ortólogos de pectinases a ser empregados no desenvolvimento de genótipos de cana-de-açúcar, apresentando biomassa com reduzida recalcitrância fazendo uso da engenharia genética, visando aumentar a produção de etanol. Nesse sentido, o objetivo deste projeto é avaliar o efeito da superexpressão e o silenciamento de ScEPG I (endopoligalacturonase) sobre a formação do aerênquima em raízes, bem como sobre a composição e dinâmica da parede celular de colmos em cana-de-açúcar. Para atingir este objetivo serão usadas diversas ferramentas ou estratégias: isolamento e clonagem de sequencias, desenho de construções genicas para modificação genética, produção de linhagens transgênicas, perfil de expressão de transcritos e atividade enzimática de glicosil hidrolases, caracterização bioquímica e anatômica dos distintos polímeros da parede celular, rendimento de sacarificação, entre outros. O projeto trará informações inéditas sobre o papel da ScEPG I, na degradação pectinas e o seu impacto especifico durante a formação do aerênquima, enfatizando as oportunidades e desafios de usar o ScEPG I, como ferramenta de engenharia genética, para alterar a parede celular de colmos, principais fontes de biomassa lignocelulosica em cana-de-açúcar, visando ajudar a impulsionar as práticas tradicionais de melhoramento genético e abordagens biotecnológicas para o desenvolvimento do etanol de segunda geração. (AU)